Особенности антиоксидантной системы и полиморфизмов некоторых генов-кандидатов у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени

Обоснование

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является самой распространенной среди диффузных болезней печени во всем мире. В последние годы подчеркиваются взаимосвязь между нарушениями липидного обмена в печени, изменениями антиоксидантного статуса и полиморфизмом генов, влияющих на метаболизм жирных кислот при НАЖБП. В настоящей статье продемонстрированы результаты исследования показателей антиоксидантной системы, некоторых полиморфизмов генов, потенциально ассоциированных с патологическим процессом в печени и некоторых генов антиоксидантной системы у пациентов с НАЖБП. Методы. Всего в исследовании приняли участие 114 пациентов, из них 67 больных верифицированной НАЖБП и 47 – с синдромом раздраженного кишечника, которые составили группу контроля. Всем пациентам произведена оценка показателей антиоксидантного статуса и ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция и полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), анализ генов GSTA, GSTР, SOD2, PPARA, UCP2 и UCP3. Результаты. У пациентов с НАЖБП выявлено увеличение активности процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ), при этом ожидаемого снижения активности ферментов системы антиоксидантной защиты (глутатион-S-трансферазы, каталазы) не отмечено. При анализе полученных данных генетического исследования установлено статистически значимое повышение частоты выявления полиморфизма гена UCP-2 и более частое сочетание однонуклеотидных полиморфизмов в генах UCP2 и UCP3 у пациентов с НАЖБП в отличие от пациентов контрольной группы. Заключение. Результаты исследования антиоксидантной статуса у пациентов с НАЖБП, с одной стороны, демонстрируют один из компонентов патогенеза НАЖБП – усиление ПОЛ, с другой – вероятную активацию протективных систем гепатоцитов в ответ на повреждение – отсутствие снижения и даже повышение активности ферментов антиоксидантной системы. Полученные при генетическом исследовании данные указывают на возможную ассоциацию выявленных полиморфизмов генов UCP2 и UCP3 с компонентами патогенеза НАЖБП.

Введение

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) на протяжении последних десятилетий занимает лидирующие позиции по распространенности среди диффузных заболеваний печени [1]. Чаще всего НАЖБП имеет доброкачественный характер, однако с жировой дистрофией печени ассоциированы воспалительные процессы в гепатоцитах с развитием неалкогольного стеатогепатита (20–30%) и в последующем – фиброза [2, 3]. Скорость наступления необратимых фиброзных трансформаций при НАЖБП меньше по сравнению с другими хроническими заболеваниями печени, такими как токсические (алкогольные) или вирусные, но в связи с высокой распространенностью данной патологии декомпенсированные циррозы печени в исходе этой проблемы являются третьими среди причин трансплантации печени в ряде стран [4–6]. Кроме того, пациенты с НАЖБП имеют высокий риск ранних сердечно-сосудистых заболеваний и смертности [7]. Вызывает беспокойство, что до 50% случаев НАЖБП-ассоциированных гепатоцеллюлярных карцином могут возникать в отсутствие цирроза, что ухудшает прогноз [8].
К настоящему времени опубликованы многочисленные работы, посвященные элементам многофакторного патогенеза НАЖБП: изменениям липидного обмена, митохондриальной дисфункции, паренхиматозному воспалению, оксидативному стрессу, роли кишечной микробиоты в патологическом процессе. Большое внимание уделяется вопросам молекулярных механизмов трансформации стеатоза в стеатогепатит, роли окислительного стресса как одного из важных звеньев патогенеза хронических заболеваний печени и поиску генов-кандидатов, потенциально ассоциированных с процессом развития стеатоза печени [9–12].

Аспекты модификации гепатоцитарного липидного обмена при НАЖБП

НАЖБП – состояние, при котором гепатоциты, обычно удерживающие только небольшое количество липидов, содержат сверхфизиологическое количество жира вследствие дисбаланса между процессами окисления и удаления липидов и превышающими их процессами поглощения и синтеза жиров [13, 14]. В исследованиях C. D. De et al. (1995) было установлено, что при стеатозе печени происходит повышенное окисление жира микро- и пероксисомами [15], увеличивается интенсивность как окисления липидов, так и цикла трикарбоновых кислот, тогда как кетогенез не модифицируется. Все это позволяет предположить, что гепатоциты пытаются противодействовать избытку липидов за счет усиления окисления [16]. Накопление в печени насыщенных жирных кислот (ЖК) может также способствовать редокс-дисбалансу и образованию активных интермедиатов кислорода, главным образом вызывая стресс и апоптоз эндоплазматического ретикулума [17]. Реактивные формы кислорода (ROS) в настоящее время рассматриваются в качестве регуляторов метаболизма липидов печени в физиологических и патологических условиях. Несмотря на то что ROS и реактивные формы азота образуются вследствие обычного метаболизма, при заболеваниях печени отмечается повышенная продукция свободных радикалов, превышающая защитный порог печеночных клеток и индуцирующая их гибель [18].

Известно, что печень играет центральную роль на всех этапах метаболизма липидов, включая липогенез посредством конверсии избыточных углеводов; окисление ЖК; метаболизм холестерина и фосфолипидов. Так как некоторые данные свидетельствуют, что увеличение уровней ROS индуцирует различные сигнальные пути, которые могут являться триггерами инсулинорезистентности, редокс-контроль может включаться при раннем развитии жирового гепатоза [19].

Контроль липидного обмена осуществляется сетью ядерных рецепторов, которые реагируют на несколько лигандов, регулируя экспрессию ферментов, участвующих в липогенезе или липоксидации печени [20]. Несколько эндогенных и экзогенных липидов, таких как холестерин или ЖК, действуют как физиологические лиганды ядерных рецепторов, которые в связи с этим можно рассматривать как «липостаты», поскольку их активация часто способствует метаболизму/катаболизму соответствующих лигандов и/или обеспечивает отрицательную обратную связь для самопрекращения синтеза [21].

Среди различных ядерных рецепторов, участвующих в физиологической регуляции метаболизма липидов и патологической модуляции свободными радикалами при стеатозе печени, важная роль отводится рецепторам, активируемым пролифераторами пероксисом-α/-γ/-δ (PPAR α/γ/δ). Особенно актуален для печеночной паренхимы PPAR-α, который регулирует гены, ответственные за захват и окисление ЖК, гены, отвечающие за липидный гомеостаз макрофагов, таким образом опосредуя баланс между клеточными ЖК и метаболизмом глюкозы, предотвращая накопление липидов в печени и играя протективную роль в патогенезе неалкогольного стеатогепатита. Активированные ЖК рецепторы PPAR регулируют метаболизм липидов в печени и других органах (PPARα), запасание жира в жировой ткани (PPARγ) [22]. Активация PPARα стимулирует экспрессию аполипопротеина АV и подавляет экспрессию аполипопротеина СIII печенью, что приводит к снижению уровней триглицеридов в хиломикронах и липопротеидов очень низкой плотности, высвобождению ЖК, которые захватываются и накапливаются в адипоцитах или метаболизируются в скелетных мышцах [23]. Несмотря на многочисленные исследования, нет полной ясности в вопросе, каким образом снижение активности PPAR может оказывать влияние на метаболизм и вероятность НАЖБП, что требует дальнейшего исследовательского поиска.

Роль полиморфизмов некоторых генов-кандидатов НАЖБП

Полагают, что разобщение окисления и фосфорилирования в митохондриях ассоциируется с контролем массы тела и жироотложения, в т.ч. и в гепатоцитах. Семейство митохондриальных разобщающих белков (UCP – uncoupling proteins) является членом семейства белков – носителей митохондриального аниона (MACP) и активно исследуется в последние 10–15 лет. Полагают, что белки UCP2, UCP3 и, возможно, другие разобщающие белки выполняют роль метаболического триггера, присутствие которого в митохондриальной мембране позволяет переключать метаболизм с углеводного на преимущественно жировой [24]. Ген UCP1 (термогенин) экспрессируется главным образом в бурой жировой ткани, однако при определенных условиях данный ген экспрессируется и в скелетных мышцах, белой жировой ткани и в β-клетках поджелудочной железы [25]. В последние годы активное внимание уделяется возможному участию белков UCP2 и UCP3 в патогенезе метаболических заболеваний, включая НАЖБП. Данные современной литературы об участии генов разобщающих белков, как UCP2, так и UCP3, в патогенезе НАЖБП противоречивы.

Белок UCP2 обнаруживается в скелетных мышцах, белой жировой ткани, легких и почках, а также в сердце и центральной нервной системе. Белок UCP2 расположен на внутренней мембране митохондрий и выступает в роли медиатора протонной утечки, что в конечном итоге приводит к уменьшению производства АТФ и высвобождению энергии. Ранее сообщалось о связи полиморфизма гена -866G >A UCP2 (rs659366) с ожирением и диабетом 2 типа. Основные полиморфизмы гена UCP2 составляют -866G>A (rs659366), 55 Ala/Val (rs660339). Помимо этого встречаются сведения о влиянии высокой экспрессии UCP2 на контроль продукции митохондриального супероксида, снижая таким образом активность перекисного окисления липидов (ПОЛ). Поэтому UCP2 может быть терапевтической мишенью для лечения окислительного повреждения и метаболического дисбаланса при НАЖБП [26].
Экспрессия UCP3 ограничена главным образом скелетными мышцами [27]. Ряд полиморфизмов был идентифицирован в гене UPC3. В частности, полиморфизм -55C/T отвечает за уровни м-РНК UPC3 и прирост массы тела. Например, по данным исследований, среди тучных индонезийских детей испытуемые с генотипами T/T UPC3 продемонстрировали более низкие общие затраты энергии, чем те, у которых были другие генотипы. Но не было подтверждено увеличение риска, связанного с вариантом rs1800849 с развитием НАЖБП [28]. Однако недавние исследования показывают, что основная роль белка UCP3 заключается в метаболизме ЖК и, возможно, в защите митохондрий от индуцированного липидами повреждения 10 за счет снижения продукции митохондриальных реактивных форм кислорода (ROS) [29].

Экспрессия генов UPC3 и UCP2, несомненно, оказывает влияние на увеличение скорости метаболизма. Однако остается спорным ассоциация таковых полиморфизмов с прогрессированием НАЖБП и это диктует необходимость проведения дополнительных исследований, позволяющих выявлять или опровергать потенциальные роли полиморфизмов UCP3 и UCP2 в патогенезе НАЖБП.

Роль полиморфизмов некоторых генов антиоксидантной защиты при НАЖБП

Антиоксидантные защитные механизмы в печени включают химические вещества, такие как глутатион (GSH), витамины C и E, и ферменты супероксиддисмутазы (SOD), каталаза (CAT), глутатионпероксидаза (GPX), глутатион S-трансфераза (GST), глутатионредуктазу (GRx), пероксиредоксины и тиоредоксины [30]. Система генов GST играет важную роль в процессах обеспечения и поддержания нормальной жизнедеятельности всех живых организмов. Это связано прежде всего с тем, что гены, входящие в состав данной системы, кодируют ферменты, катализирующие различные типы химических превращений в клетке. Именно данная система генов играет первостепенную роль, принимая участие во второй фазе детоксикации (обезвреживания) ксенобиотиков и в защите клеток против окислительного стресса [31].

В отчетах исследований последних лет сообщается также о тенденции к росту экспрессии м-РНК GST A1 и P1 в процессе прогрессирования НАЖБП. Индукция м-РНК GST P1 ранее была признана маркером гепатоцеллюлярного канцерогенеза у крыс, но может быть связана с гепатоцеллюлярной карциномой у людей и, вероятно, может быть предиктором предрасположенности к гепатоцеллюлярной карциноме [32].

Мнения ученых о процессах трансформации системы антиоксидантной защиты в печени при НАЖБП на сегодняшний день противоречивы. Показано, что содержание GSH в печени и активность SOD снижены у пациентов со стеатозом печени и еще более снижены у больных стеатогепатитом [33]. Исследование на животных (мышах fa/fa, получавших диету с высоким содержанием жиров) подтвердило снижение уровня GSH в печени, а также снижение активности GRx, GPX, SOD и CAT [34].

Напротив, в ряде исследований выявлялось, что активность Cu2+/Zn2+-SOD, CAT и GPX заметно повышена в печени пациентов с НАЖБП, так же как экспрессия гена SOD и CAT [35, 36]. Активность марганец-зависимой SOD (MnSOD) защищает от ROS детоксикационными супероксидами в кислород и пероксид водорода, увеличение содержания которых способствует более высокому окислительному стрессу при НАЖБП. В японской популяции у пациентов с НАСГ общий вариант гена 1183T/T MnSOD приводил к замещению аминокислот в сигнальной последовательности, нацеленной на фермент в митохондриях, что ослабляет способность MnSOD, способствуя уменьшению MnSOD и увеличению кислородных радикалов в митохондриях, в конечном итоге формируя гепатоцеллюлярное повреждение [37].

Другой полиморфизм, MnSOD (C47T, rs4880), был исследован как возможный ассоциативный фактор при НАСГ и фиброзе, поскольку белковый импорт в митохондриях уменьшался при таких вариантах гена. Отмечено, что концентрация MnSOD снижается у мужчин с НАЖБП, но не у женщин, возможно из-за различий в уровнях половых гормонов. Таким образом, низкий уровень MnSOD обеспечивает восприимчивость пациентов мужского пола к увеличению окислительного стресса и бóльшую вероятность прогрессирования заболевания [38].

Исследование показателей антиоксидантной системы и полиморфизма генов GSTA, GSTР, SOD2, PPARα, UCP2 и UCP3 у пациентов с НАЖБП

Первые ступени НАЖБП представляются изменениями гепатоцеллюлярного редокс-статуса, которые приводят к нарушенной регуляции метаболизма липидов. С другой стороны, изменения липидного обмена модифицируют окислительно-восстановительные процессы гепатоцита, приводя к митохондриальной дисфункции, инсулинорезистентности, накоплению жира, еще более усиливая повреждение печени. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этих изменений, до конца не понятны, но, вероятно, включают редокс-модификацию активности и экспрессии ферментов, модуляцию посттрансляции и активации ядерных рецепторов с последующим изменением метаболической сети и ослаблением системы антиоксидантной защиты гепатоцеллюлярного матрикса. Специфические генетические изменения и мутации различных генов могут приводить к усиленному синтезу и поглощению липидов и/или снижению β-окисления свободных ЖК и накоплению триглицеридов. В свою очередь постоянное состояние увеличения ROS вызывает экспрессию антиоксидантных генов посредством активации элемента антиоксидантного ответа [39].

Цель нашего исследования:

1. Оценить показатели антиоксидантной системы (АОС) у пациентов с НАЖБП: активность SOD, CAT, GST; общий антиоксидантный статус и показатели ПОЛ.
2. Определить частоту полиморфизмов генов GSTA, GSTР, SOD2, PPARα, UCP2 и UCP3 у пациентов с НАЖБП.

Методы

Проведено одномоментное проспективное обсервационное аналитическое (случай–контроль). Путем сплошной выборки в исследование были включены 67 пациентов с верифицированной НАЖБП, сформирована основная группа исследования (группа 1). Диагноз НАЖБП устанавливался на основании результатов комплексного обследования в соответствии с существующими международными и российскими стандартами. Для достижения поставленных целей сформирована группа сравнения (группа 2) из 47 пациентов, не имевших НАЖБП и органической патологии желудочно-кишечного тракта. В исследование не включали пациентов старше 80 лет, с тяжелой коморбидной патологией; критериями исключения также стали острые гепатиты любой этиологии, хронические заболевания печени этиологии, иной, чем НАЖБП (вирусные, алкогольные, аутоимунные гепатиты и проч.).
Обследование пациентов проведено амбулаторно, а также в условиях стационара на базе клиники кафедры пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и диетологии Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова.

Все пациенты подвергались физикальному обследованию с акцентом на состояние желудочно-кишечного тракта. Выясняли жалобы, анамнез (длительность заболевания, наследственность, прием алкоголя, лекарственных препаратов, сопутствующую патологию), объективно оценивали состояние печени (размеры, однородность, плотность, край, болезненность и т.д.), проводилась оценка массы тела (ИМТ – индекс массы тела), измерение окружности талии.

Для оценки показателей антиоксидантной системы всем пациентам проведены лабораторные исследования образцов сыворотки крови, полученной из венозной крови стандартными методами. В сыворотке крови осуществлено спектрофотометрическое исследование активности общего антиоксидантного статуса и антиоксидантных ферментов: GST, ПОЛ, СОД и CAT. Определение активности выполнено с использованием наборов фирмы «Randox» согласно инструкции производителя.

Для определения частот полиморфизмов генов GSTA, GSTР, SOD2, PPARα, UCP2 и UCP3 всем участникам исследования был выполнен ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция и полиморфизм длин рестрикционных фрагментов)-анализ. Использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов крови с помощью наборов «Проба–Рапид–Генетика» («ДНК-технология»).

ПЦР-ПДРФ-анализ генов GSTA, GSTР, SOD2, PPARA, UCP2 и UCP3 осуществлен с помощью соответствующих двухпраймерных систем (НПФ «Бигль», СПб., Россия). Для амплификации специфических фрагментов ДНК в реакционную смесь добавляли 2–3 мкл ДНК и проводили ПЦР на термоциклере «Терцик». Рестрикция синтезированных фрагментов ДНК проведена с помощью специфической для каждого однонуклеотидного генетического полиморфизма эндонуклеазы. Анализ длин рестрикционных продуктов проведен электрофоретическим разделением в 8%-ном полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете при помощи трансиллюминатора «ECX-20M» (Vilber Lourmat,Франция).

Все пациенты – участники исследования подписали информированное согласие, а также согласие на обработку персональных данных. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова.

Группа пациентов с верифицированным диагнозом НАЖБП включала 67 пациентов, средний возраст – 46,5±11,7 года. В гендерном распределении несколько преобладали женщины – 39 (58,2%). Все пациенты страдали избыточной массой тела (среднее по группе значение ИМТ – 35,2±4,3 кг/м2).
Для решения задач, поставленных для достижения целей, сформирована группа сравнения из пациентов, не имевших НАЖБП. Всего в группу сравнения были включены 47 пациентов с синдромом раздраженного кишечника (СРК), из них – 29 (61,7%) женщин и 18 (38,3%) мужчин, средний возраст – 41,6±14,1 года. Диагноз СРК был установлен в соответствии с Римскими критериями III пересмотра. В этой группе средний ИМТ составил 22,2±3,2 кг/м2.
Для статистической обработки полученных данных была использована программа SPSS 17.0 (SPSS Inc., США). Вследствие выраженных отличий распределения вариационных рядов от нормального распределения, выявленных тестами Колмогорова–Смирнова и Фишера, для описательной статистики были выбраны медиана и квартили, а для анализа данных использованы непараметрические статистические критерии. Сравнение двух групп проведено по номинальным показателям с помощью χ2-критерия, по количественным показателям – с помощью критерия Манна–Уитни.

Результаты исследования

Результаты исследования антиоксидантного статуса в группах. В анализируемых группах при сопоставлении значений показателя общего антиоксидантного статуса у пациентов с НАЖБП и у пациентов группы сравнения статистически значимых различий не получено (Me=324,1 и Me=324,2 мкмоль/л соответственно; p=0,673), кроме того, отмечено, что данные значения были выше референтных.

Полученные результаты значений показателей общего антиоксидантного статуса, GST, CAT, СОД и ПОЛ у пациентов в обеих группах представлены в табл. 1.



Среднее значение ПОЛ в обеих исследовательских группах было выше референсного показателя. При сравнении показателей ПОЛ в группах отмечено статистически значимое увеличение среднего значения показателя у пациентов с НАЖБП (рис. 1). Показатели ПОЛ были выше референтных значений у подавляющего большинства (63; 94%) пациентов группы 1 и у большинства (32; 68,1%) пациентов группы 2.



Средние значения уровня СОД у пациентов группы 2 были снижены. Снижение показателя отмечено у 38 (56,7%) пациентов группы 1 и у 23 (48,9%) – группы 2, у других пациентов показатели были либо в пределах референтных значений, либо повышены, но достоверных различий в группах получено не было.

Уровень CAT выше референтных значений у пациентов 1-й группы диагностирован в 46 (68,7%), у пациентов 2-й группы – в 29 (61,7%) случаях. При оценке средних значений CAT также достоверных различий между группами 1 (Ме=780,4±270,4) и 2 (Ме=745,4±254,4) не было (р=0,431).

У 31 (46,3%) пациента группы 1 и у 36 (76,6%) – группы 2 показатели GST были снижены, при этом у пациентов группы 2 средние значения данного показателя снижались значительно, в то время как у пациентов группы 1 средний показатель значений GST был в пределах референсных (44,3±30,9 и 70, 36,8 соответственно, различия в группах достоверны; р<0,0004).
Результаты исследования полиморфизма генов GSTA, GSTР, SOD2, PPARA, UCP2 и UCP3 в анализируемых группах. При исследовании полиморфизма генов GSTA и GSTР статистически значимых различий между сравниваемыми группами не получено.

У пациентов обеих группа чаще выявлялся полиморфизм гена GSTA, замена аллеля С на аллель Т, что отмечено у 39 (58,2%) пациентов группы 1 и у 33 (70,2%) – группы 2 (табл. 2).

При оценке полиморфизма SOD2 и PPARα не было выявлено статистически значимых различий между исследуемыми группами. Чаще всего выявлялся гетерозиготный аллель Ala/Val гена SOD2, при этом в группе пациентов с НАЖБП – у 32 (47,8%) пациентов, в контрольной группе – у 28 (59,6%); 37 (55,2%) пациентов группы 1 чаще имели гомозиготный аллель G/G гена PPARα, при этом у 25 (53,2%) пациентов группы 2 отмечен полиморфизм гена PPARα в виде гетерозиготного аллеля G/C (табл. 3).



Обращает на себя внимание полиморфизм генов UCP2 и UCP3 и сочетанный полиморфизм обоих генов (табл. 4). У пациентов группы 1 полиморфизм генов UCP2 и UCP3 диагностирован в 79,1 и 65,7% случаев соответственно. У пациентов группы 2 полиморфизм гена UCP2 зарегистрирован в 57,4%, гена UCP3 – в 51,1% случаев. При этом комбинация полиморфизма генов UCP2 и UCP3 статистически значимо чаще выявлялась у пациентов группы с НАЖБП (у 38 [56,7%] пациентов) по сравнению с группой контроля – 15 (31,9%) пациентов (р<0,05; рис. 2).

Обсуждение

У пациентов с НАЖБП в данном исследовании отмечены более высокие значения показателей ПОЛ, что демонстрирует его активный статус. Полученные данные не противоречат сведениям литературы, посвященным этому вопросу, которые широко освещают роль активности ПОЛ в прогрессировании НАЖБП. Именно при усилении ПОЛ повреждаются мембраны гепатоцитов, их прогрессирующая гибель запускает воспалительную реакцию, создает предпосылки к активации фиброгенеза. На этом фоне нарастает выработка провоспалительных цитокинов, которые наряду с реактивными формами кислорода, дикарбоксильными кислотами и продуктами микросомального окисления способствуют разобщению процессов окислительного фосфорилирования, истощению митохондриальной АТФ и в конечном итоге – некрозу и апоптозу гепатоцитов. Продукты ПОЛ повышают продукцию макрофагами трансформирующего фактора роста β и продукцию коллагена, активируя звездчатые клетки, что приводит к активации фиброгенеза [40].

По многочисленным литературным данным, оксидативный стресс приводит к истощению антиоксидантных механизмов, в частности системы GSH, включающей GSH и ферменты его метаболизма: CAT, глутатионредуктазу, глутатионтрансферазу, глутатионпероксидазу. Известно, что GST – группа ферментов, ответственных за конъюгацию сульфгидрильной SH2 группы с электрофильными атомами C, N, S, O молекул ксенобиотиков. GST катализирует реакцию глутатиона с различными алифатическими, ароматическими, эпоксидными и гетероциклическими радикалами экзогенных повреждающих веществ [41]. Однако в представленном исследовании не было отмечено значимого снижения уровня GST в обследуемой группе пациентов с НАЖБП, средние значения этого показателя по группе оставались в пределах референсных значений, а сниженная активность фермента отмечена менее чем в половине случаев – у 46,3% больных. Кроме того, в группе сравнения у пациентов, не имевших НАЖБП, выявлены статистически значимо более низкие показатели активности GST. У обследуемых пациентов в обеих группах имела место высокая частота полиморфизма генов-кандидатов GSTA и GSTP (система GSH), но достоверных различий получено не было.

У обследованных нами пациентов с НАЖБП активность CAT в целом была выше нормативных значений, высокая активность фермента выявлена у большего, чем в контрольной группе, числа пациентов, но при этом не отличалась статистически значимо. Нами не было получено достоверных различий между группами по показателю активности SOD: уровень SOD отмечен в пределах референтных значений в обеих группах, но при этом снижение показателя отмечено у 38 (56,7%) пациентов группы 1 и у 23 (48,9%) – группы 2, что может указывать на более высокий уровень окислительного стресса. При оценке полиморфизма SOD2 и PPARα не были выявлены статистически значимые различия между исследуемыми группами.

Полученные в нашем исследовании данные – повышение активности ферментов антиоксидантной защиты, в частности общего антиоксидантного статуса, вероятно, можно связать с активацией защитных систем и ответным протективным «ударом» в ответ на усиление ПОЛ.

В ходе нашего исследования у пациентов с НАЖБП установлена более высокая частота мутаций гена UCP2 в виде замены аллеля ala на val и увеличение частоты комбинаций однонуклетидных полиморфизмов, касающихся наличия аллелей val и t, в генах UCP2 и UCP3. Возможно предположить, что высокая частота мутаций в генах разобщающих белков 2 и 3 ассоциирована с НАЖБП и вносит вклад в патогенез этого заболевания, вероятнее всего за счет дефектов разобщения жирных кислот, что в свою очередь способно вызывать митохондриальное повреждение, тем самым запуская порочный круг метаболических нарушений.

В результате проведенного исследования у пациентов обеих групп выявлены нарушения различных компонентов антиоксидантной системы, несмотря на это, средние показатели статистически значимо были неотличимыми. Возникает сложность оценки показателей в связи с тем, что невозможно подобрать пациентов для репрезентативной выборки одной возрастной группы, не имеющих патологии различных органов и систем.

Заключение

НАЖБП вызвана многими факторами, включающими в себя и чрезвычайно сложный патофизиологический процесс, и совместное действие множественных механизмов. Функция полиморфизмов генов, которые влияют на метаболизм ЖК, окислительный стресс и гепатофиброгенез, отражаются в каждой части патогенеза НАЖБП. Из-за сложности и ограничения исследований полиморфизма генов-кандидатов при НАЖБП большинство работ выполняется с невысокой статистической мощностью, воспроизводимостью и с наличием неоднородных по стадии заболевания изучаемых групп, что также влияет на эффективность результатов.

Более полные знания о молекулярных сигнальных путях, участвующих в патогенезе НАЖБП и способствующих прогрессированию стеатоза печени, могут открыть путь к научным стратегиям профилактики и терапии, таким как фармацевтические препараты, непосредственно нацеленные на антиоксидантную систему или действующие через ядерные рецепторы либо гены, в т.ч. разобщающих белков, а также на метаболизм ЖК. Тем не менее продолжение научного поиска в этом направлении оправданно, поскольку понимание воздействия полиморфизма генов на патогенез НАЖБП поможет определить риски заболевания и определить эффективные стратегии лечения.

Список литературы

1. Bellentani S., Scaglioni F., Marino M., Bedogni G. Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease. Dig. Dis. 2010;28:155–61. Doi: 10.1159/000282080.
2. Rolo A.P., Teodoro J.S., Palmeira C.M. Role of oxidative stress in the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis. Free Radic. Biol. Med. 2012;52:59–69. Doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2011.10.003.
3. Бакулин И.Г., Сандлер Ю.Г., Кейян В.А. и др. Оценка стеатоза печени с помощью неинвазивного метода: миф или реальность? Доктор.Ру. 2015;12(113):57–64.
4. Fassio E., Alvarez E., Dominguez N., et al. Natural history of nonalcoholic steatohepatitis: a longitudinal study of repeat liver biopsies. Hepatology. 2004;40:820–26. Doi: 10.1002/hep.20410.
5. Charlton M.R., Burns J.M., Pedersen R.A., et al. Frequency and outcomes of liver transplantation for nonalcoholic steatohepatitis in the United States. Gastroenterology. 2011;141:1249–53. Doi: 10.1053/j.gastro.2011.06.061.
6. Бакулин И.Г., Шаликиани Н.В. Патогенез алкогольного заболевания печени: современные представления. Доктор.Ру. 2015;12(113):7–14.
7. Belfort R., Harrison S.A., Brown K., et al. A placebo-controlled trial of pioglitazone in subjects with nonalcoholic steatohepatitis N. Engl. J. Med. 2006;355:2297–307. DOI: 10.1056/NEJMoa060326.
8. Betrapally N.S., Gillevet P.M., Bajaj J.S. Changes in the Intestinal Microbiome and Alcoholic and Nonalcoholic Liver Diseases: Causes or Effects? Gastroenterology. 2016;150(8):1745–55. Doi: 10.1053/j.gastro.2016.02.073.
9. Caldwell S.H., Swerdlow R.H., Khan E.M., et al. Mitochondrial abnormalities in non-alcoholic steatohepatitis. Hepatol. 1999;31:430–34.
10. Chatham J., Chacko V.P., Arnold C., et al. Alterations in H. liver ATP homeostasis in human nonalcoholic steatohepatitis: a pilot study. JAMA. 1999;282:1659–64.
11. Serviddio G., Bellanti F., Tamborra R., et al. Alterations of hepatic ATP homeostasis and respiratory chain during development of non-alcoholic steatohepatitis in a rodent model. Eur. J. Clin. Invest. 2008;38:245–52. Doi 10.1111/j.1365-2362.2008.01936.x.
12. Betrapally N.S., Gillevet P.M., Bajaj J.S. Changes in the Intestinal Microbiome and Alcoholic and Nonalcoholic Liver Diseases: Causes or Effects? Gastroenterology. 2016;150(8):1745–55. Doi: 10.1053/j.gastro.2016.02.073.
13. Timlin M.T., Parks E.J. Temporal pattern of de novo lipogenesis in the postprandial state in healthy men. Am. J. Clin. Nutr. 2005;81:35–42. Doi: 10.1093/ajcn/81.1.35.
14. Donnelly K.L., Smith C.I., Schwarzenberg S.J., et al. Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease.Аm. J. Clin. Invest. 2005;115:1343–51. Doi: 10.1172/JCI23621.
15. De C.D., Pauwels M., Van den Branden C. Alterations of peroxisomes in steatosis of the human liver: a quantitative study. Hepatology. 1995;22:744–52.
16. Sunny N.E., Parks E.J., Browning J.D., Burgess S.C. Excessive hepatic mitochondrial TCA cycle and gluconeogenesis in humans with nonalcoholic fatty liver disease. Cell. Metab. 2011;14:804–10. Doi: 10.1016/j.cmet.2011.11.004.
17. Wei X., Wang D., Topczewski F., Pagliassotti M.J. Saturated fatty acids induce endoplasmic reticulum stress and apoptosis independently of ceramide in liver cells. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2006;291:275–81. Doi: 10.1152/ajpendo.00644.2005.
18. Muriel P. Role of free radicals in liver diseases. Нepatol. Int. 2009;3:526–36.
19. Houstis N.,. Rosen E.D., Lander E.S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 2006;440:944–8. Doi:: 10.1038/nature04634.
20. Arrese M., Karpen S.J. Nuclear receptors, inflammation, and liver disease: insights for cholestatic and fatty liver diseases. Clin. Pharmacol. Ther. 2010;87:473–78.
21. Wagner M., Zollner G., Trauner M. Nuclear receptors in liver disease. Hepatology. 2011;53:1023–34. Doi: 10.1002/hep.24148.
22. Spiegelman B.M. PPARγ: adipogenic regulator and thiazolidinedione receptor. Diabetes. 1998;4:507–14.
23. Бондарева Э.А., Андреев Р.С., Якушкин А.В. и др. Полиморфизм генов разобщающих белков семейства UCP у футболистов: в поисках функциональной роли. Физиология человека. 2016;42(6):70–80.
24. Schrauwen P., Hoeks J., Hesselink M.K. Putative function and physiological relevance of the mitochondrial uncoupling protein-3: involvement in fatty acid metabolism? Prog. Lipid. Res. 2006;45(1):17–41. Doi: 10.1016/j.plipres.2005.11.001.
25. Boudina S., Graham T.E. Mitochondrial function/dysfunction in white adipose tissue. Exp. Physiol. 2014;99(9):1168–78. Doi: 10.1113/expphysiol.2014.081414.
26. Farhangi M., Mohseni F., Farajnia S., Jafarabadi M. Major components of metabolic syndrome and nutritional intakes in different genotype of UCP2 −866G/A gene polymorphisms in patients with NAFLD. Transl. Med. 2016;14:177. Doi: 10.1186/s12967-016-0936-3.
27. Brondani L.A., Assmann T.S., Duarte G.C., et al. The role of the uncoupling protein 1 (UCP1) on the development of obesity and type 2 diabetes mellitus. Arq. Bras. Endocrinol. Metabol. 2012;56:215.
28. Wang C., Gong J., Wu H. Development of gene polymorphisms in meditators of nonalcoholic fatty liver disease. Biomed. Rep. 2017;7(2):95–104. Doi: 10.3892/br.2017.926.
29. Комелина Н.П., Амерханов З.Г. Разобщающие белки UCP2 и UCP3 митохондрий печени и мышц суслика spermophilus undulates в отличие от UCP1 бурого жира не способны к неспецифическому транспорту пирувата. Биологические мембраны. Журнал мембранной и клеточной биологии. 2013;30(5–6): 412–21.
30. Leclercq A. Antioxidant defence mechanisms: new players in the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis? Clin. Sci.2004;106:235–37. Doi:10.1042/CS20030368.
31. Leiers B., Kampkötter A., Grevelding C.G., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Radic. Biol. Med. 2003;34(11):1405–15. Doi:10.1016/S0891-5849(03)00102-3
32. Fuchs M., Sanyal A.J. Lipotoxicity in NASH. J. Hepatol. 2012;56:291–3. Doi: 10.1016/j.jhep.2011.05.019.
33. Videla L.A., Rodrigo R., Orellana M., et al. Oxidative stress-related parameters in the liver of non-alcoholic fatty liver disease patients. Clin. Sci. 2004;106:261–68. Doi: 10.1042/CS20030285.
34. Carmiel-Haggai M., Cederbaum A.I., Nieto N. A high-fat diet leads to the progression of non-alcoholic fatty liver disease in obese rats. FASEB J. 2005;19:136–38. Doi: 10.1096/fj.04-2291fje.
35. Perlemuter G., Davit-Spraul A., Cosson C., et al. Increase in liver antioxidant enzyme activities in non-alcoholic fatty liver disease. Liver Int. 2005;25:946–53. Doi:10.1111/j.1478-3231.2005.01126.x.
36. Kohjima M., Enjoji M., Higuchi N., et al. Re-evaluation of fatty acid metabolism-related gene expression in nonalcoholic fatty liver disease. Int. J. Mol. Med. 2007;20:351–58.
37. Li L Yang X. The Essential Element Manganese, Oxidative Stress, and Metabolic Diseases: Links and Interactions. Oxid. Med. Cell. Longev. 2018:7580707. Doi: 10.1155/2018/7580707.
38. Borrelli A., Bonelli P., Tuccillo F.M., et al. Role of gut microbiota and oxidative stress in the progression of non-alcoholic fatty liver diseaseto hepatocarcinoma: Current and innovative therapeutic approaches. Redox Biol. 2018;15:467–79. Doi: 10.1016/j.redox.2018.01.009.
39. Yates M.S., Tran Q.T., Dolan P.M., et al. Genetic versus chemoprotective activation of Nrf2 signaling: overlapping yet distinct gene expression profiles between Keap1 knockout and triterpenoid-treated mice. Carcinogenesis. 2009;30:1024–31. Doi: 10.1093/carcin/bgp100.
40. Променашева Т.Е. Роль оксидативного стресса и системы глутатиона в патогенезе неалкогольной жировой болезни печени. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2014;5(99):80–3.
41. Hashemi M., Eskandari-Nasab E., Fazaeli A., et al. Association of genetic polimorphisms of glutathione-S-transferase genes (GSTT1, GSTM1 and GSTP1) and susceptibility to nonalcoholic fatty liver disease in Zahedan. DNA Cell. Biol. 2012;31(5):7–672. Doi: 10.2217/bmm.12.61.

Журнал «Фарматека», выпуск №9 (362)